做神經(jīng)科學(xué)研究的人對α-Bungarotoxin這個名字應(yīng)該不會陌生。它是從銀環(huán)蛇毒液中分離出的一種小分子蛋白毒素能高特異性地結(jié)合煙堿型乙酰膽堿受體nAChR在研究神經(jīng)肌肉接頭、受體聚集和定量分析時是繞不開的工具分子。但有個很現(xiàn)實的問題裸的毒素分子在顯微鏡下看不見。于是人們給它接上熒光基團讓這個“定位神器”同時具備可視化能力AF350標(biāo)記的α-銀環(huán)蛇毒素AF350-α-Bungarotoxin就是其中最常用的商品化探針之一。這篇文章主要面向做神經(jīng)生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及生理學(xué)研究的同行特別是需要檢測nAChR分布、追蹤受體聚集或定量細(xì)胞膜表面受體密度的人。不管你在做神經(jīng)肌肉突觸發(fā)育還是在研究α7型受體參與的調(diào)節(jié)機制后面關(guān)于結(jié)合原理、染色流程、對照設(shè)計和踩坑經(jīng)驗的展開應(yīng)該都能直接幫到你。1. 項目定位AF350-α-Bungarotoxin是什么解決什么問題1.1 α-Bungarotoxin一個被低估的“配體級”工具分子α-Bungarotoxin是眼鏡蛇科銀環(huán)蛇毒液中的主要神經(jīng)毒素之一屬于典型的“三指毒素”家族。分子量約8 kDa由74個氨基酸殘基組成空間上像三根并排的手指一樣延伸出來。它最出名的能力就是與煙堿型乙酰膽堿受體nAChR的α亞基發(fā)生結(jié)合。對肌肉型受體而言解離常數(shù)可以低到亞納摩爾甚至皮摩爾級別哪怕是親和力弱一些的α7同源五聚體結(jié)合的緊密程度也遠(yuǎn)超大多數(shù)抗體。正因為結(jié)合速度夠快、解離極慢α-Bungarotoxin在英文文獻(xiàn)里經(jīng)常被描述為practically irreversible binding。這張“強力膠”一樣的性質(zhì)在實際操作中意味著你孵育完、洗干凈之后信號不會自己掉下來后續(xù)的洗滌、固定、甚至長時間觀察都不會明顯丟失標(biāo)記。對做定量實驗的人來說這是非常寶貴的性質(zhì)因為它保證了每個時間點讀出的信號都代表孵育那一刻的受體分布狀態(tài)。我見過不少人第一次用這個東西時有一個誤區(qū)總覺得抗體更特異天然毒素只能算個配體。實際上對于nAChR這類膜受體α-Bungarotoxin結(jié)合的是受體胞外結(jié)構(gòu)域中的經(jīng)典正構(gòu)配體結(jié)合口袋它標(biāo)記的恰好是受體處于“可結(jié)合配體”的功能狀態(tài)而抗體結(jié)合的表位可能在任意位置不一定反映受體的活性構(gòu)象。所以在很多實驗中毒素探針提供的信息比抗體更能說明問題。1.2 為什么要在毒素上接一個AF350AF350全稱是Alexa Fluor 350是Alexa染料家族里偏紫外激發(fā)的藍(lán)色熒光染料激發(fā)峰大約在346 nm發(fā)射峰在442 nm附近。把這樣一個熒光基團偶聯(lián)到α-Bungarotoxin上之后原本“看不見”的配體分子就變成了一個熒光探針?biāo)廊槐Ａ魧AChR的高親和力同時把結(jié)合位置、數(shù)量和動態(tài)變化轉(zhuǎn)化為顯微鏡下可采集的光學(xué)信號。選擇AF350而不是更流行的綠色或紅色熒光有幾個很實際的理由。首先很多神經(jīng)科學(xué)實驗本來就帶著GFP和RFP這類熒光蛋白構(gòu)建體想追蹤多個分子時綠色和紅色通道往往已經(jīng)占滿這時一個藍(lán)色通道的探針就能在同一個視野里實現(xiàn)三色成像不同通道之間的光譜串?dāng)_很小。其次部分組織標(biāo)本在橙紅色區(qū)域的自發(fā)熒光很強但藍(lán)色激發(fā)光的自發(fā)熒光相對容易控制在做好對照的前提下信號更干凈。當(dāng)然藍(lán)色熒光也有自己的短板。紫外波段激發(fā)光能量高光漂白和光毒性都比較明顯普通DAPI濾塊雖然能采集到AF350的信號但波長窗口和細(xì)胞核染料的發(fā)射譜重疊。設(shè)計實驗時需要把這些考慮進(jìn)去后面我會專門說多色搭配的問題。2. 分子的核心原理結(jié)合、標(biāo)記與活性保持2.1 受體結(jié)合位點的分子邏輯與“不可逆”結(jié)合要理解這個探針為什么這么好用得先看看它結(jié)合在哪兒。肌肉型nAChR是一個由2個α亞基和β、δ、γ或成年型的ε組成的五聚體受體兩個α亞基分別參與形成兩個正構(gòu)配體結(jié)合位點一個位于α-δ界面一個位于α-γ或α-ε界面。α-Bungarotoxin的三根“手指”會插進(jìn)這個結(jié)合口袋里通過多個氫鍵和疏水相互作用把受體表面牢牢“按住”。為什么解離這么慢這跟毒素分子本身的構(gòu)象剛性和結(jié)合表面積有關(guān)。三指結(jié)構(gòu)展開后覆蓋的氨基酸殘基數(shù)量相當(dāng)多和受體形成的接觸面積大而多對非共價鍵同時維系意味著要讓它們逐個斷開是很困難的。所以哪怕后續(xù)用大量緩沖液沖洗也幾乎不能把已經(jīng)結(jié)合的毒素洗下來。實際操作中如果發(fā)現(xiàn)洗完之后信號反而更干凈多半是洗掉的是非特異吸附真正特異結(jié)合的部分穩(wěn)穩(wěn)留在原處。有讀者可能會追問那這個探針結(jié)合過之后會不會抑制受體本身的天然功能會而且這正是它的另一個用途。α-Bungarotoxin本身就常被用作nAChR的功能阻斷劑在電生理或藥理實驗中合適濃度下可以特異性地阻斷受體通道。在染色實驗中我們用量很低不追求阻斷效果但這個特性從側(cè)面說明它結(jié)合的確實是功能相關(guān)的正構(gòu)位點。2.2 AF350偶聯(lián)的化學(xué)原理與標(biāo)記率AF350這類熒光染料偶聯(lián)到蛋白質(zhì)上用的通常是NHS酯琥珀酰亞胺酯化學(xué)。產(chǎn)物中帶活化酯基團的AF350會和蛋白質(zhì)表面的伯胺基團發(fā)生?；磻?yīng)主要是賴氨酸殘基的ε-氨基也包括蛋白N端的α-氨基。α-Bungarotoxin分子表面分布著若干賴氨酸反應(yīng)產(chǎn)物并不是每個分子都偶聯(lián)了相同數(shù)量的染料而是一個分布有的毒素分子掛了1個AF350有的掛了3個、5個平均標(biāo)記率通常用F/P比值表示。這里有一個很關(guān)鍵的平衡標(biāo)記率太低熒光信號弱標(biāo)記率太高也不一定是好事。因為AF350分子雖然不大但大量染料堆在蛋白表面一來染料之間會發(fā)生自淬滅二來偶聯(lián)位點如果恰好靠近受體結(jié)合界面可能產(chǎn)生空間位阻讓毒素結(jié)合nAChR的能力下降。商品化產(chǎn)品通常會把F/P控制在2~5之間用戶拿到手不需要自己偶聯(lián)但了解這個機制對判斷批間差異很有幫助。我遇到過一種情況同一個產(chǎn)品換了一個批次后染色亮度明顯下降怎么排查都查不到細(xì)胞問題最后查看COA才發(fā)現(xiàn)新批次的F/P比從4掉到了2左右。所以做定量比較實驗時盡量用同一批次的產(chǎn)品如果必須換批次最好重新做一個濃度梯度預(yù)實驗別照搬原來的工作濃度。2.3 為什么這套標(biāo)記方案能在活細(xì)胞上使用一個重要且容易被忽略的點活細(xì)胞染色要求探針本身對細(xì)胞沒有明顯毒性、不會誘發(fā)劇烈的內(nèi)吞或干擾受體功能。α-Bungarotoxin在實驗用量下通常1~10 μg/mL并不會引起細(xì)胞明顯死亡而且它分子小不像某些抗體那樣會通過交聯(lián)受體而顯著觸發(fā)內(nèi)吞只要孵育時間控制在合理范圍內(nèi)膜表面受體仍然保持在原位。AF350本身水溶性好偶聯(lián)物在生理緩沖液中不易聚沉這也保證了活細(xì)胞染色時背景相對干凈。需要明確的是AF350不是鈣指示劑或膜電位染料它偶聯(lián)到毒素之后只報告nAChR的位置不會因為膜電位或離子濃度變化而改變熒光強度。所以它適合做靜態(tài)分布、半定量評估如果想要高速追蹤受體在膜上的側(cè)向運動對顯微鏡的靈敏度和采集速度會提出更高要求。3. 實操全流程從染色到成像的完整方案3.1 實驗前準(zhǔn)備與濃度計算做實驗前先把材料備齊。除了AF350-α-Bungarotoxin探針本身還建議準(zhǔn)備含鈣鎂的PBS或HBSS活細(xì)胞染色用、無血清培養(yǎng)基、4% PFA固定液、未標(biāo)記的α-Bungarotoxin做競爭對照必備、封閉液1%~5% BSA以及滲透液如果染胞內(nèi)抗原。拿到商品化探針先看說明書確認(rèn)濃度。多數(shù)產(chǎn)品提供1 mg/mL左右的溶液分裝后-20℃避光保存。α-Bungarotoxin的分子量約8 kDa所以1 mg/mL約等于125 μM。染色工作濃度一般從100 nM左右開始也就是把儲備液稀釋1000倍以上到約1 μg/mL。不同細(xì)胞系和受體亞型表達(dá)水平差異很大建議第一次做時先跑一個濃度梯度0.5、1、2、5 μg/mL四個濃度看哪個濃度下信噪比最理想。這個預(yù)實驗千萬別偷懶。我最初用肌管細(xì)胞時直接用了推薦濃度結(jié)果圖像亮得刺眼但背景也不低后來把濃度降到1 μg/mL把孵育時間從30分鐘延長到1小時信號依然很強背景卻干凈了很多。高濃度不一定帶來更好的結(jié)果關(guān)鍵是找到特異信號和非特異吸附之間的平衡點。3.2 活細(xì)胞標(biāo)記步驟活細(xì)胞染色比固定染色更能反映受體在細(xì)胞表面的真實分布尤其在研究受體聚集、內(nèi)化或膜轉(zhuǎn)運時活細(xì)胞實驗幾乎是必需的。以貼壁培養(yǎng)細(xì)胞為例我的標(biāo)準(zhǔn)流程是先把細(xì)胞接種在玻璃底培養(yǎng)皿中生長至70%~80%密度棄掉培養(yǎng)基后用預(yù)溫的HBSS或PBS洗兩次洗掉殘留血清因為血清蛋白會跟染料結(jié)合增加背景。染液的配制用無血清培養(yǎng)基或HBSS把AF350標(biāo)記毒素稀釋到工作濃度。孵育條件根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇4℃孵育1小時可以最大限度減少受體內(nèi)吞保留膜表面信號37℃孵育30分鐘信號更均勻但部分受體會被內(nèi)化。如果研究目標(biāo)是追蹤受體從膜表面到胞內(nèi)的過程那么37℃孵育后立即換液、按時間點成像就能記錄內(nèi)吞動態(tài)如果只是想看膜表面受體分布4℃方案更穩(wěn)。孵育結(jié)束后洗3次每次5分鐘。洗滌很重要但也不要過于劇烈否則細(xì)胞容易從培養(yǎng)皿上飄起來。隨后換成不含酚紅的成像緩沖液采集圖像因為酚紅在紫外-藍(lán)光激發(fā)下有干擾。整個過程盡量避光、快速AF350雖然比很多藍(lán)光染料耐受一些但紫外激發(fā)的光漂白和光毒性還是明顯操作要干凈利落。3.3 固定細(xì)胞與組織切片染色如果不需要觀察活細(xì)胞動態(tài)或者要做多輪染色的復(fù)雜標(biāo)記固定標(biāo)本更方便。貼壁細(xì)胞用4% PFA室溫固定15~20分鐘即可然后用PBS洗3次。多數(shù)研究nAChR的切片染色并不需要透化因為受體位于膜表面毒素能直接接觸但如果你還想同時染胞內(nèi)蛋白那就需要用含0.1%~0.3% Triton X-100的PBS透化10分鐘。這一步要謹(jǐn)慎透化會破壞膜結(jié)構(gòu)可能導(dǎo)致部分膜表面信號變?nèi)?。封閉后用稀釋好的探針孵育4℃過夜或室溫2小時。對組織切片比如神經(jīng)肌肉接頭標(biāo)本α-Bungarotoxin的優(yōu)勢極其明顯。以小鼠膈肌鋪片為例固定后直接加1 μg/mL探針染1小時清洗后就能看到終板區(qū)域一條條清晰的亮帶。整個肌肉鋪片厚度有限8 kDa的毒素分子可以輕松滲透甚至不需要透化處理。如果是厚度較大的腦片可以適當(dāng)延長孵育時間到4℃過夜以獲得更均勻的滲透。3.4 成像參數(shù)與多色搭配建議AF350的成像參數(shù)激發(fā)濾片選330~385 nm窄帶發(fā)射濾片用420~480 nm普通DAPI通道就能覆蓋。曝光時間我習(xí)慣從50 ms開始根據(jù)信號強度逐步調(diào)整不要一上來就拉滿否則背景和自發(fā)熒光會一起放大。如果使用寬場顯微鏡紫外激發(fā)下的組織自發(fā)熒光可能比較明顯可以嘗試開2×2 binning犧牲一點分辨率換取更高的信噪比。多色搭配是很容易踩坑的環(huán)節(jié)。比較穩(wěn)妥的組合是AF350藍(lán) GFP綠 遠(yuǎn)紅染料近紅外三種顏色在光譜上分得很開。如果同時想染細(xì)胞核不要用DAPI因為DAPI和AF350的發(fā)射光譜重疊兩者在同一個藍(lán)色通道里根本無法區(qū)分?？梢愿挠眉t色或遠(yuǎn)紅核染料比如PI、DRAG5或TO-PRO-3把核信息挪到紅色通道里。還有一點在做三色成像前最好用單色標(biāo)記樣品確認(rèn)每個通道沒有串色。特別是綠色熒光蛋白在紫外激發(fā)下也可能產(chǎn)生少量信號如果你發(fā)現(xiàn)藍(lán)色通道里隱約出現(xiàn)了GFP陽性細(xì)胞的輪廓大概率不是AF350串色而是紫外光直接激發(fā)了GFP。這時候可以縮小激發(fā)帶寬或換一個更窄的發(fā)射濾塊。3.5 對照組設(shè)計與定量扣除nAChR染色最常見的問題不是“染不上”而是“染色不特異”。α-Bungarotoxin對受體親和力很高但在高濃度時也可能有較弱的非特異吸附組織標(biāo)本中還存在其他能跟毒素發(fā)生弱結(jié)合的組分。最經(jīng)典的驗證方法是競爭阻斷實驗用100倍摩爾比以上的未標(biāo)記α-Bungarotoxin先孵育標(biāo)本30分鐘再加入AF350標(biāo)記探針。如果信號被顯著抑制說明標(biāo)記探針和未標(biāo)記毒素競爭的是同一類位點也就是真正的nAChR。這個對照應(yīng)該在每種新標(biāo)本上重復(fù)。我曾經(jīng)為了省事漏掉對照組結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個組織信號怎么都消不掉后來做了競爭阻斷才發(fā)現(xiàn)那是一處非特異沉積。做定量分析時競爭組的殘余信號可以作為背景值扣除。用ImageJ做受體密度測定時我會在同樣條件下拍實驗組和競爭組的圖像對競爭組取平均灰度作為背景再在實驗組灰度中扣除這個值得到的相對密度就更接近真實情況。4. 常見問題與排查技巧實錄4.1 信號弱先查濃度、孵育時間和光路別急著換產(chǎn)品信號弱的原因多數(shù)出在工作濃度太低或孵育時間太短。以1 μg/mL、4℃ 1小時為例對高表達(dá)受體的肌管細(xì)胞通常足夠亮但遇到低豐度受體比如腦片上的α7 nAChR可能要把濃度提高到5 μg/mL孵育時間延長到2~4小時甚至4℃過夜。遇到這類情況我建議先做一個簡單的劑量梯度不要跳步。還要檢查顯微鏡光路。紫外激發(fā)光在經(jīng)過濾塊、物鏡和鏡組后的損耗相當(dāng)大如果用的還是一盞用了多年的汞燈信號衰減會非常明顯。優(yōu)先用LED光源或共聚焦的紫外激光線重新校正光路或者換一塊透光效率更好的紫外濾塊往往比加濃度更有效。4.2 背景高洗滌、封閉和自發(fā)熒光逐一排查背景高通常有幾種來源?；罴?xì)胞染色時背景可能來自殘留血清與非特異蛋白的結(jié)合這就是為什么染液要用無血清培養(yǎng)基配、且在染色前把細(xì)胞洗兩遍。固定組織背景可能來自自發(fā)熒光尤其是血管壁、紅細(xì)胞和膠原纖維在紫外激發(fā)下有較強的本底這在肌肉組織和腦片中很常見。處理策略增加洗滌次數(shù)和延長洗滌時間固定標(biāo)本可嘗試在洗滌液中加入0.1% Tween-20染液稀釋液中加入1% BSA可以降低非特異吸附。對于頑固的自發(fā)熒光還可以考慮用硼氫化鈉還原處理后固定切片以減少醛類交聯(lián)產(chǎn)生的熒光但這個方法對某些熒光蛋白信號可能產(chǎn)生影響要在自己的體系里先驗證。4.3 熒光信號逐漸衰減注意保存和避光如果整個批次都在變暗多半是探針保存出了問題。AF350-α-Bungarotoxin要分裝后-20℃避光保存避免反復(fù)凍融。凍融次數(shù)多了偶聯(lián)物可能降解或聚集表現(xiàn)在染色上就是信號越來越弱。另外染好的切片如果不馬上拍照盡量保存在4℃避光環(huán)境中封片得當(dāng)?shù)脑捒梢苑€(wěn)定數(shù)周但別指望長期保存后信號和新鮮染色完全一樣?；罴?xì)胞成像時還要注意采集速度。紫外光反復(fù)打在同一個區(qū)域熒光衰減會很快。設(shè)計時間序列實驗時盡量縮短曝光時間或者降低激發(fā)光強度寧可幀間間隔長一點也不要讓每一個時間點的信號都在快速下降。4.4 多色干擾從光源、濾塊和標(biāo)記方案三處入手多色成像中你會發(fā)現(xiàn)藍(lán)色通道里出現(xiàn)綠色細(xì)胞的輪廓這大概率不是AF350的串色而是紫外激發(fā)光直接激發(fā)了綠色熒光蛋白。解決方式有三種減小激發(fā)光帶寬、使用更窄的發(fā)射濾塊或者引入光譜拆分功能。如果你的顯微鏡沒有光譜拆分最簡單的方法是把綠色熒光蛋白的激發(fā)濾塊盡量避開紫外波段或者換用更特異性的綠色染料。還有一個組合性問題是AF350與DAPI沖突前面已經(jīng)強調(diào)過。我的經(jīng)驗是“一個視野里藍(lán)色通道只留給AF350”這條原則要嚴(yán)格執(zhí)行寧可多花點時間把核染到紅色通道也不要讓藍(lán)色通道同時承載兩種信號否則后面定量時光譜拆分會很讓人頭疼。下表是我常用來排錯的一個速查思路。現(xiàn)象可能原因優(yōu)先檢查項特異性信號弱濃度低、時間短、光路效率下降做濃度梯度、檢查紫外濾塊與光源背景整體偏高血清殘留、封閉不足、自發(fā)熒光充分洗滌、加BSA、增加封閉時間藍(lán)通道出現(xiàn)綠色輪廓紫外光激發(fā)GFP換窄帶濾塊或做單通道預(yù)檢信號隨批次下降F/P差異、保存不當(dāng)查看COA、分裝避光保存藍(lán)通道核信號過強DAPI與AF350光譜重疊換紅色/遠(yuǎn)紅核染料4.5 安全操作提醒再溫和也是毒蛋白雖然商品化熒光探針的使用濃度極低但α-Bungarotoxin本質(zhì)上是神經(jīng)毒素。操作時建議戴雙層手套在通風(fēng)櫥內(nèi)稀釋避免氣溶膠和皮膚接觸。用過的染液、洗滌液和廢液都按有毒廢物統(tǒng)一處理?；罴?xì)胞染色尤其注意液體可能濺出操作臺墊上一次性吸水紙會穩(wěn)妥很多。我實驗室的規(guī)矩是每次用完在冰箱門上登記領(lǐng)用量和剩余量這樣既清楚庫存也方便廢棄物流轉(zhuǎn)溯源。雖然是件小事但在實際管理里幫了不少忙。5. 應(yīng)用場景從神經(jīng)肌肉接頭到受體動態(tài)篩選5.1 神經(jīng)肌肉接頭研究最經(jīng)典的主場AF350-α-Bungarotoxin最經(jīng)典、最成熟的應(yīng)用方向就是神經(jīng)肌肉接頭NMJ的形態(tài)與功能研究。神經(jīng)肌肉接頭是運動神經(jīng)末梢與骨骼肌纖維之間的突觸突觸后膜上聚集著極高密度的肌肉型nAChR這些受體在終板區(qū)域形成特征性的彎曲突起。用標(biāo)記毒素染色后可以非常直觀地看到受體的分布形態(tài)研究去神經(jīng)支配后的受體變化、神經(jīng)再支配時的受體聚集以及agrin/LRP4/MuSK信號通路對受體聚簇的調(diào)控。做肌纖維染色時整塊肌肉鋪片后染色是最常見的方案。我習(xí)慣把肌肉固定在稍微拉伸的狀態(tài)下避免收縮導(dǎo)致受體形態(tài)變形。染色后發(fā)現(xiàn)終板信號呈現(xiàn)“弧形亮帶”或“假性皺褶”樣結(jié)構(gòu)說明受體聚集成熟如果信號彌散、亮帶不連續(xù)通常提示受體聚集受阻。這種形態(tài)學(xué)判斷做起來很快信息量卻很大。5.2 中樞與外周α7受體的定位α7型nAChR在海馬、皮層等腦區(qū)有表達(dá)也是很多藥物研發(fā)的靶點。用AF350-α-Bungarotoxin可以對這些受體進(jìn)行組織化學(xué)定位比如標(biāo)記腦片中α7陽性區(qū)域。但要注意α7受體的表達(dá)密度通常比肌肉型受體低很多染色條件需要更強我把濃度提到2~5 μg/mL4℃孵育過夜并且建議用高靈敏的相機或共聚焦系統(tǒng)采集圖像否則容易出現(xiàn)“感覺像沒染上”的結(jié)果。不過也需要提醒的是α-Bungarotoxin在中樞組織中對α7受體有較高親和力但并不僅僅結(jié)合α7如果標(biāo)本里混有其他能跟毒素起反應(yīng)的亞基信號解讀要謹(jǐn)慎。最好還是配上α7特異性抗體做共定位驗證或者用α7基因缺失的組織做陰性對照。5.3 受體膜動態(tài)追蹤活細(xì)胞里的時間軸活細(xì)胞體系中AF350-α-Bungarotoxin的另一個有趣應(yīng)用是追蹤受體膜轉(zhuǎn)運。先4℃標(biāo)記膜表面受體把探針“凍”在膜上然后升高溫度并啟動時間序列成像就能看到標(biāo)記受體被內(nèi)吞、進(jìn)入囊泡并運動的過程。如果同時標(biāo)記早期內(nèi)體或溶酶體可以重建受體從膜表面到胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運軌跡。這種實驗有幾個細(xì)節(jié)。第一4℃標(biāo)記完后要充分洗滌避免游離探針在升溫后繼續(xù)結(jié)合并干擾信號第二升溫到37℃后動作要快盡早開始采集因為第一批內(nèi)吞事件往往在幾分鐘內(nèi)就發(fā)生第三紫外激發(fā)光對細(xì)胞有光毒性長時間追蹤時盡量縮短每幀曝光時間用更低的激光功率和更大步長的時間間隔來換取細(xì)胞活性。5.4 定量篩選與流式分析AF350-α-Bungarotoxin還可以配合流式細(xì)胞術(shù)做nAChR表達(dá)水平的半定量檢測。細(xì)胞經(jīng)標(biāo)記、洗滌后上機藍(lán)色通道的平均熒光強度反映受體表達(dá)水平的相對高低。比起Western blot需要裂解細(xì)胞且無法區(qū)分細(xì)胞表面與胞內(nèi)受體流式的優(yōu)勢在于可以直接定量細(xì)胞表面功能性受體的數(shù)量。在做藥物篩選時可以用標(biāo)記毒素的結(jié)合強度作為讀出信號觀察藥物處理對受體表達(dá)和膜定位的影響。輸出指標(biāo)可以取平均熒光強度或者陽性細(xì)胞比例。需要注意的是流式細(xì)胞術(shù)的紫外激光配置不是所有機器都有用之前先確認(rèn)機器支持藍(lán)色熒光檢測通道如果沒有紫外激光只能改用其他熒光標(biāo)記版本的α-Bungarotoxin設(shè)計實驗時要提前確認(rèn)。5.5 個人實操體會與幾個容易被忽略的細(xì)節(jié)做這類受體探針實驗這幾年我最深的感受是這工具的關(guān)鍵不在把毒素染上去而在于把“非特異”和“特異性”分開。每個新系統(tǒng)、新細(xì)胞系、新組織類型都要花10分鐘做一次競爭對照和濃度梯度省掉的這一步往往會在后面變成幾個小時都解釋不了的數(shù)據(jù)。另外還有三個細(xì)節(jié)容易被忽略。一是做定量比較時務(wù)必保持同一批號產(chǎn)品和完全一致的成像參數(shù)否則不同批次的F/P差異會直接影響信號強度二是藍(lán)色波段的成像對光路潔凈度要求很高物鏡和濾塊上的一點灰塵就會被紫外光放大定期清潔光學(xué)元件能明顯改善信噪比三是新的實驗人員上手前最好先拿已知高表達(dá)的神經(jīng)肌肉接頭標(biāo)本練一次手熟悉了“應(yīng)該多亮”的標(biāo)準(zhǔn)再去做真正表達(dá)量偏低的樣本時會少走很多彎路。