合成生物學(xué)系列第一彈質(zhì)粒提取實驗前言合成生物學(xué)是目前研究的熱點之一也是眾多養(yǎng)菌人重點的shui論文方向bushi身為一個養(yǎng)菌人終于大學(xué)畢業(yè)了為了更好的激勵我自己系統(tǒng)性的梳理一遍我的知識網(wǎng)我會給大家從上游到下游從實驗設(shè)計實驗操作生信分析等多角度進行樹立從宏觀到微觀展示給大家下面是我目前整理的流程圖后期可能還會更新變動。先劃重點質(zhì)粒提取的核心是把細菌里的環(huán)狀質(zhì)粒DNA和基因組DNA、蛋白、RNA等雜質(zhì)分離開拿到純凈的質(zhì)粒為后續(xù)分子克隆、基因編輯、測序等實驗鋪路簡單說提得好實驗成功一半提崩了半天功夫全白費耗時30-40min主要實驗器材單通道移液槍金屬浴高速離心機主要試劑omega質(zhì)粒小提試劑盒實驗流程菌液在搖床中生長至對數(shù)期將培養(yǎng)的菌液8000×g離心3min4℃冰箱中保存的Solution I拿出用移液槍吸取250μL加入離心管中并吹吸混勻以重懸菌體并將重懸后液體轉(zhuǎn)移至1.5mL EP管中加入250μL Solution II多次顛倒混勻靜置3min加入300μL Solution III立減顛倒至白色絮狀物出現(xiàn)13000×g離心10min取上清700μL轉(zhuǎn)移至吸附柱中13000×g離心1min棄液在吸附柱中加入500μL HBC Buffer13000×g離心1min棄液加入700μL DNA Wash Buffer13000×g離心1min并重復(fù)60℃金屬浴中開蓋靜置6min以提高提取率并提前將ddH2O放置在金屬浴上吸附柱放置1.5mL EP管上在吸附柱中心白色處加入50μL ddH2O靜置1min后13000×g離心1minNanoDrop取2μL液體測提取濃度保證后續(xù)試驗NanoDrop結(jié)果解讀檢測指標理想范圍結(jié)果解讀異常原因 處理方案質(zhì)粒濃度≥50ng/μL濃度合格能滿足后續(xù)酶切、克隆、測序等實驗需求濃度偏低/μL① 菌液量太少 / 搖菌不足→下次加 2mL 菌液 洗脫不充分→按 “點涂法” 加 ddH2O可重復(fù)洗脫 1 次③ 吸附柱失效→換全新試劑盒A260/A2801.8-2.0純度合格幾乎無蛋白污染低于 1.8蛋白污染① 吸上清時吸到沉淀→下次少吸 50-100μL② HBC Buffer 洗滌不充分→增加 1 次 HBC Buffer 洗滌 高于 2.0RNA 污染① 試劑盒無 RNase→加少量 RNase A終濃度 10μg/mL37℃孵育 15min重新純化A260/A2701.5-1.8無酚類雜質(zhì)污染低于 1.5酚污染① 洗滌步驟省略→嚴格按流程洗 2 次 DNA Wash Buffer 忘加乙醇→補加乙醇后重新洗滌實驗小tips第1步搖菌時間根據(jù)菌株來定比較常用的大腸桿菌是8h。第4步有在不同情況下有一些不同的操作技巧。第一種情況是樣本不多的情況這里的顛倒可以改成在EP管架上不同孔間摩擦管底以混勻。如果是樣品較多可以用兩個EP管架夾住管頂管底顛倒混勻。其實第4步主要目的是把白色的蛋白雜質(zhì)沉下來根據(jù)我的經(jīng)驗其實10min一般這個蛋白沉淀的也不會特別好用槍頭吸的時候離的近了該吸還是會吸上來我大概縮短了時間試了幾遍其實大概5min到7min就差不多了當(dāng)然如果你是要送去測序最好還是按標準做主要怕送測序公司時間比較長怕蛋白污染太嚴重。如果只是要做點突的話就還好你甚至可以少吸一點反正后面還要PCR。第9步這里最重要的點其實是加的水一定要滴在吸附柱的那層樹脂上槍頭一定要挨上因為這一步是為了把吸附柱的質(zhì)粒溶在水里離下來通常加的體積又比較小不容易加進去所以一定要注意。另外如果貼上之后水因為太緊打不出去的話教大家一個小技巧就是可以用槍頭打一點在柱子上然后抬起來一下然后再貼上去一點一點把水打到柱子上那個白色的部分會把水吸住。最開始課上做這個實驗的時候班里幾乎所有人都敗下其實就是因為這一步?jīng)]做好導(dǎo)致提出來的濃度很低。如果你提取的質(zhì)粒后面會用去做同源重組比如Gibson質(zhì)粒的濃度通常在50-120ng/μL即可與目的基因的濃度差距越大無論是濃度過低還是濃度過高需要做出體積變化越大不利于加樣過程。如果用PCR儀做定點突變濃度要求會更低一些只需調(diào)整質(zhì)粒及模板體積即可。合成生物學(xué)系列還在持續(xù)更新感興趣的同學(xué)可以訪問我的主頁